C57BL/6J小鼠

包括實(shí)驗(yàn)材料（實(shí)驗(yàn)動物、試劑、儀器）、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、細(xì)胞培養(yǎng)/載體構(gòu)建/蛋白表達(dá)/病原培養(yǎng)鑒定方法、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程、動物處理倫理等內(nèi)容。

（一）構(gòu)建GPR68-FloxP小鼠

GPR68只有一個蛋白編碼區(qū)exon1。因此在exon1的兩邊設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)，將FloxP基因插入GPR68基因兩端。

圖1 插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)

（二）CD4+T細(xì)胞特異性敲除GPR68小鼠的構(gòu)建

圖2 GPR68-FloxP小鼠與CD4-Cre小鼠雜交

 將GPR68-Flox/Flox小鼠與CD4-Cre小鼠雜交，子代小鼠即為CD4+T細(xì)胞GPR68特異敲除小鼠。

（三）皮下移植黑色素瘤模型的構(gòu)建

1、用0.25%胰酶消化細(xì)胞收集細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min，洗滌細(xì)胞兩次，除去單細(xì)胞懸液中的血清。

2、對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用PBS稀釋細(xì)胞至濃度為2.5×10⁶個/mL，接種體積控制在0.2mL。

3、采用1mL無菌注射器于小鼠腋下部位接種細(xì)胞。接種時將單細(xì)胞懸液充分混勻，防止細(xì)胞成團(tuán)導(dǎo)致活性降低以及接種細(xì)胞數(shù)不均，左手固定小鼠，右手執(zhí)注射器，針頭在皮下穿行時避免刺破皮膚與肌肉，到達(dá)接種位點(diǎn)并注射完畢后退出針頭時避免細(xì)胞懸液溢出。

4、每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，測量腫瘤最長和最短直徑。腫瘤體積計(jì)算公式為V=a×b²/2(a為長軸，b為短軸)。

5、接種后第20天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出腫瘤組織，稱量小鼠腫瘤重量。

CD4+T細(xì)胞GPR68特異敲除小鼠外觀表現(xiàn)與野生型C57BL/6J小鼠無明顯差異，生理?xiàng)l件無異常表型； DNA、mRNA、蛋白水平檢測CD4+T細(xì)胞中均無GPR68表達(dá)。

1. DNA鑒定

提取小鼠脾臟中的CD4+T細(xì)胞，采用全式金DNA提取試劑盒提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

2. mRNA鑒定

    提取小鼠脾臟中的CD4+T細(xì)胞，采用賽默飛反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過Real time PCR鑒定小鼠CD4+T細(xì)胞中mRNA水平GPR68的表達(dá)情況。

3. 蛋白表達(dá)鑒定

提取小鼠脾臟中的CD4+T細(xì)胞，采用賽默飛蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量后通過Western blot鑒定小鼠CD4+T細(xì)胞中蛋白水平GPR68的表達(dá)情況。