6~8 周齡 SPF 級(jí)雌性 C57BL/6N 小鼠

1.1實(shí)驗(yàn)材料

 C57BL/6N 小鼠（北京維通利華，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐鐵注射液（江西創(chuàng)導(dǎo)動(dòng)物保健品有限公司），血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)試劑盒（酶免公司），組織鐵檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），普魯士藍(lán)染色試劑盒（Solarbio），結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv（菌號(hào)為 93009，本室保存），中性羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分枝桿菌快速培養(yǎng)管（BD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鐵過(guò)載小鼠模型建立

 6~8 周齡 SPF 級(jí)雌性 C57BL/6N 小鼠隨機(jī)分成陰性對(duì)照、低劑量、中劑量和高劑量 4 個(gè)小組，實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射右旋糖酐鐵3.75、7.5、15 mg/次，陰性對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，3 次/周，共計(jì) 4 周。定期觀察小鼠生長(zhǎng)及精神狀態(tài)，稱重并記錄。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指標(biāo)與組織鐵含量測(cè)定 

 建模完成后將小鼠摘眼球采血，4 ℃凝結(jié)過(guò)夜，2000 g 4 ℃離心 10 min，分離小鼠血清并檢測(cè)血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白及可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量。解剖取小鼠心臟，肝臟、脾臟、肺、腎臟及小腸等組織器官，稱重后加 1ml 生理鹽水充分研磨并裂解組織碎片，12000 g 4 ℃離心 20 min，取上清并測(cè)定蛋白濃度。 血清生化檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，組織鐵測(cè)定則按試劑盒測(cè)定方法計(jì)算相同蛋白濃度下各組織鐵含量。

1.2.3 鐵過(guò)載小鼠 Mtb 感染

SPF 級(jí) C57BL/6N 隨機(jī)分成空白對(duì)照組、空白 Mtb 感染組、中劑量鐵過(guò)載模型組和中劑量鐵過(guò)載模型 Mtb 感染組，每組 6 只。其中 Mtb 感染組小鼠經(jīng)尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 H37Rv 單細(xì)胞菌懸液 100 μl（1×10 ⁶ CFU/ml），空白對(duì)照組注射等劑量無(wú)菌生理鹽水。本所 ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室（國(guó)衛(wèi) ABSL3-059） 正常飼喂， 觀察并記錄小鼠臨床表現(xiàn)，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠組織荷菌量測(cè)定

ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物解刨臺(tái)中解剖感染小鼠，無(wú)菌取小鼠肺、脾和肝臟組織；拍照記錄肺、脾和肝臟等器官大體病變情況，取小鼠左肺、脾頭及肝小葉于生物 安全柜內(nèi)稱重，依次經(jīng) 2%稀硫酸溶液、生理鹽水漂洗 30 s，1 ml 生理鹽水溫和 勻漿后進(jìn)行 10倍倍比稀釋，分別取 10^-3，10^-4和 10 ^-5 稀釋液 50 µl 均勻涂布于中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37℃培養(yǎng) 4 周，計(jì)算相應(yīng)的組織器官荷菌量。另取 10 ^-1稀釋液 500 μl 接種于 BD BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng)，通過(guò)記錄報(bào)陽(yáng)時(shí)間進(jìn)行結(jié)核菌的快速檢測(cè)。

1.2.5 組織切片

HE染色與鐵染色 小鼠各組織器官，10%中性福爾馬林溶液固定 48 h。組織按長(zhǎng)軸最大橫切面修塊、梯度乙醇脫水、石蠟包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后掃描載玻片并保存為 NanoZoomer 數(shù)字病理圖像，不同視野下拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。鐵染色組織切片脫蠟至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸餾水充分沖洗切片5 min，入核固紅染色液，淡染細(xì)胞核 10 min，自來(lái)水沖洗 5 s。常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固，晾干后拍照觀察其病理形態(tài)改變及鐵沉積程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  

SPSS16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同實(shí)驗(yàn)處理組之間差異比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柱形圖采用 GraphPad Prism 5 軟件制作。

1、 表型分析

1.1 鐵過(guò)載小鼠組織形態(tài)及體重評(píng)估

鐵過(guò)載小鼠外觀與正常小鼠無(wú)明顯區(qū)別，自主活動(dòng)穩(wěn)定，精神狀態(tài)平穩(wěn)。 解剖后正常小鼠各臟器組織表面光滑，無(wú)充血、水腫。鐵過(guò)載小鼠肝臟顏色呈暗褐色，且隨著右旋糖酐鐵劑量增加而逐漸加深，其他臟器組織無(wú)明顯顏色及形態(tài) 變化（圖 1）。低劑量組、中劑量組與陰性對(duì)照組相比體重增長(zhǎng)無(wú)顯著差異。高劑量組體重增長(zhǎng)略有減緩，且與其他劑量實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 2，P ＜ 0.05)。

            圖 1. 不同劑量鐵過(guò)載小鼠肝臟變化

           圖 2. 不同劑量鐵過(guò)載小鼠體重增長(zhǎng)百分比

*表示高劑量組與低劑量組、中劑量組及陰性對(duì)照組比較，P ＜0.05。

   2.2 鐵過(guò)載小鼠組織鐵含量變化

  鐵過(guò)載小鼠中肝組織含鐵量最高，與陰性對(duì)照組小鼠相比增加接近 7 倍。 其次，組織鐵含量由高至低依次為脾臟，腎臟及小腸。高劑量組和中劑量組各臟器組織鐵含量均顯著高于陰性對(duì)照組（圖 3，P 均 ＜ 0.05），低劑量組小鼠心臟和肺組織鐵含量顯著低于其他劑量組，與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（圖 3， P ＞ 0.05）。

            圖 3. 不同劑量鐵過(guò)載小鼠組織含鐵量

*表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.05；表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.01。

2.3 鐵過(guò)載血生化指標(biāo)變化

鐵過(guò)載小鼠分別于鐵劑注射 4 周后取外周血血清進(jìn)行血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測(cè)，結(jié)果如圖 4 所示。陰性對(duì)照組和各不同劑量鐵劑組小鼠血清鐵水平分別為19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，組間差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。進(jìn)一步檢測(cè)各組動(dòng)物外周血鐵蛋白水平分別為 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，組間差異同樣有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各劑量組小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平與正常對(duì)照組小鼠相比均無(wú)顯著差異（圖 4，P ＞ 0.05）。

圖 4. 不同劑量鐵過(guò)載小鼠血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平

(a)：血清鐵，(b)：血清鐵蛋白，(c)：血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，(d)：血清可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。*表示各不同劑量組與陰性 對(duì)照組比較，P ＜0.05；表示各不同劑量組與陰性對(duì)照組比較，P ＜0.01。

3、病理表型

鐵過(guò)載小鼠組織HE 染色與鐵染色鐵過(guò)載模型中高劑量組小鼠肝臟、脾臟和腎臟組織 HE 染色均可見(jiàn)大量團(tuán)狀含鐵血黃素沉積。肝細(xì)胞核固縮、溶解，胞漿內(nèi)滿布蛋白微粒；脾小體與紅髓區(qū)界限不清；小腸及心臟組織可見(jiàn)部分含鐵血黃素沉積，心肌纖維出現(xiàn)排列異常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血水腫、出血等病理變化；肺部可見(jiàn)小數(shù)鐵蛋白微粒，支氣管和血管周圍及其管腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞滲出，并可見(jiàn)肺泡不均勻擴(kuò)張，肺泡間隔斷裂等。中劑量組和低劑量組僅肝臟和脾臟可見(jiàn)含鐵血 黃素沉，且含鐵血黃素沉程度與鐵劑量成正相關(guān)；心臟、肺、腎臟及小腸等組織未見(jiàn)明顯含鐵血黃素沉積及炎性細(xì)胞浸入，與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（圖6）。普魯士藍(lán)染色與組織鐵含量測(cè)定結(jié)果一致，陰性對(duì)照組小鼠各組織鐵染色為陰性，高劑量組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸等組織大量胞外鐵和胞內(nèi)鐵呈顆粒狀、塊狀亮藍(lán)色鐵沉積。中劑量組肝臟和脾臟組織鐵沉積較明顯， 心臟、肺、腎臟和小腸僅可見(jiàn)小量鐵沉積，均未見(jiàn)組織形態(tài)改變。低劑量組小鼠中心臟和肺組織則未見(jiàn)明顯鐵沉積，與陰性對(duì)照組相比無(wú)顯著改變（圖 7）。

圖 6. 不同劑量鐵過(guò)載小鼠組織 HE 染色（× 20）

圖 7 不同劑量鐵過(guò)載小鼠各組織普魯士藍(lán)染色（× 20）

圖 7. 結(jié)核感染鐵過(guò)載小鼠肺脾肝組織病理變化（× 20）

3 鐵過(guò)載結(jié)核病小鼠組織荷菌量

對(duì)中劑量右旋糖酐鐵建立的鐵過(guò)載小鼠模型進(jìn)行 Mtb 感染試驗(yàn)，感染后 4 周解剖并進(jìn)行肺、脾和肝臟病理分析和荷菌量檢測(cè)，結(jié)果表明鐵過(guò)載結(jié)核病小鼠構(gòu)建成功。如圖 7 所示，肺脾及肝組織病理 HE 染色中鐵過(guò)載 Mtb 感染組肺組織出現(xiàn)多處炎癥反應(yīng)，呈實(shí)變趨勢(shì)，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞填充。結(jié)核性肉芽腫顯著增加且多于空白 Mtb 感染組。脾臟白髓被結(jié)核肉芽腫病變破壞，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞聚集，且病變較重。同樣，鐵過(guò)載 Mtb 感染小鼠肝臟可見(jiàn)水腫、淤血，光鏡下肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)團(tuán)塊狀鐵褐色沉積，Mtb 感染后出現(xiàn)多個(gè)散在小肉芽腫樣病變。同時(shí)，感染小鼠肺、脾臟和肝組織荷菌量比較發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載 Mtb 感染組荷菌量比空白 Mtb 感染組各靶器官較高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 8，P 均 ＜ 0.05）。

圖 8 結(jié)核感染鐵過(guò)載小鼠肺脾肝組織荷菌量分析

（一）模型的評(píng)價(jià)

    本模型采用的評(píng)價(jià)主要采取以整體表觀效度的評(píng)價(jià)方法，本模型分為鐵過(guò)載模型和結(jié)核感染模型兩部分。鐵過(guò)載模型的核心指標(biāo)鐵過(guò)載小鼠外周血血清鐵和鐵蛋白水平隨鐵劑注射量增加而升高，轉(zhuǎn)鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體無(wú)明顯變化。動(dòng)物各臟器組織 HE與普魯士藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載動(dòng)物各臟器均出現(xiàn)不同程度鐵沉積，且高劑量鐵劑引發(fā)小鼠肝腎損傷。

結(jié)核菌感染模型的核心指標(biāo)是感染期的組織病變和荷菌量，鐵過(guò)載小鼠感染結(jié)核菌后，鐵過(guò)載動(dòng)物肺脾肝組織結(jié)核性病變嚴(yán)重，且荷菌量較空白 Mtb 感染組增加，綜合組織荷菌量和病變指標(biāo)可以評(píng)價(jià)該模型。

（二）模型的驗(yàn)證

通過(guò)設(shè)置對(duì)照組，判定模型的成功與否，并且本模型已至少通過(guò)3個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)來(lái)重復(fù)驗(yàn)證，參數(shù)指標(biāo)穩(wěn)定。